Оценка пластичности протеома плазмы крови здорового человека в экстремальных условиях жизнедеятельности 14. 03. 08 Авиационная, космическая и морская медицина 03. 01. 09 Математическая биология, биоинформатика



На правах рукописи


Трифонова Оксана Петровна


ОЦЕНКА ПЛАСТИЧНОСТИ ПРОТЕОМА ПЛАЗМЫ КРОВИ ЗДОРОВОГО ЧЕЛОВЕКА В ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ


14.03.08 Авиационная, космическая и морская медицина

03.01.09 Математическая биология, биоинформатика


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Москва 2011


Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) и в Учреждении Российской академии медицинских наук Институте биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН (ИБМХ РАМН)


Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Ларина Ирина Михайловна

доктор биологических наук Лисица Андрей Валерьевич


Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Воронков Юрий Иванович

доктор биологических наук, доцент Ильина Елена Николаевна


Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН


Защита состоится «29» сентября 2011 г. в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 при Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН (ГНЦ РФ - ИМБП РАН), г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76а


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - ИМБП РАН, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76а


Автореферат разослан «26» августа 2011 г.


Ученый секретарь диссертационного

совета, д.б.н. Левинских М.А.

^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Анализ протеома плазмы крови позволяет выявлять белковые биомаркеры, практическая значимость которых определяется перспективой использования в сфере молекулярной диагностики и мониторинга эффективности лечения широкого спектра заболеваний (N.L. Anderson, N.G. Anderson, 2002). Крупномасштабное изучение протеома плазмы крови было проведено под эгидой международной организации HUPO (Human Proteome Organization). В рамках проекта HUPO Plasma Proteome Project (HPPP) было идентифицировано 7884 белка, как обобщенный результат 95 исследовательских проектов (Omenn G.S. et al., 2005, Klie S. et al., 2008). За последние 10 лет при исследовании различных заболеваний протеомными методами в плазме и сыворотке крови было выявлено более 200 потенциальных биомаркеров, однако, только единицы из них обладали высокой специфичностью. Первым и на настоящий момент единственным примером практического применения результатов протеомики стал многопараметрический тест OVA1, одобренный в 2009 году Американским агентством FDA для диагностики рака яичников (Anderson N.L., 2010, Hortin G.L. et al., 2010). Одной из причин такой низкой эффективности протеомных исследований является проблема биологической вариабельности контрольного биоматериала, остро стоящая в клинической протеомике.

При обнаружении в крови белков, потенциальных биомаркеров, необходимо знать, какой степенью изменчивости обладает концентрация данных белков в норме (так называемая пластичность протеома), а также - границы внутри- и межиндивидуальных различий1. Anderson&Anderson в 2002 году согласно опубликованным данным о вариабельности ряда белков, таких как протромбин, миоглобин, гаптоглобин, интерлейкин, С-реактивный белок, липопротеины выдвинули гипотезу, что индивидуальные изменения уровня белков во времени должны быть как минимум вдвое ниже чем вариабельность внутри популяции (Anderson N.L., Anderson N.G., 2002). Недавно Todd H. Corzett с соавторами (2010) провели статистический анализ внутрииндивидуальной вариабельности протеома плазмы крови с помощью дифференциального гель электрофореза (Corzett T.H. et al., 2010). Их результаты показали, что групповая вариабельность значительно превышает индивидуальные изменения протеома во времени, которые, в свою очередь, сравнимы с технической погрешностью метода. Однако авторы не принимали во внимание ни состояние здоровья, ни образ жизни, ни пол обследуемых.

Помимо значительных отличий между протеомными профилями индивидуумов и естественных изменений индивидуального протеома во времени, существуют вариации, связанные с адаптивным ответом на изменение внешних условий (Anderson N.L., Anderson N.G., 2002). Характеристика изменений белковой композиции плазмы крови является основой для изучения молекулярного ответа человека в новых условиях существования. При выполнении космических полетов, а также при участии в модельных экспериментах («сухая» иммерсия, длительная изоляция и др.) организм человека реагирует на непривычные для него условия. Изменения затрагивают все системы органов, что отражается на качественном и количественном составе белков крови. Так с помощью различных биохимических методов были выявлены изменения гормонов белковой природы (инсулина, соматотропина, ренина и других) (Ларина И.М. 2000; 2003; Григорьев А.И. с соавт., 1999), компонентов иммунной системы (иммуноглобулинов, факторов комплемента) (Гусева Е.В., Ташпулатов Р.Ю, 1979, 1980; Рыкова М.П. с соавт., 2001, 2004, 2006), белков системы свертывания крови (Фомин, А.Н., 1981) и «острой» фазы (Ларина О.Н., 1992; 2006), ферментов, в т.ч. протеолитических (Тигранян с соавт., 1987).

Протеомный анализ для оценки изменений белкового состава жидкостей тела здорового человека во время космических полетов и наземных модельных экспериментов начали применять совсем недавно. Впервые, в нашей лаборатории для анализа изменений протеома сыворотки крови здоровых добровольцев был применен метод прямого масс-спектрометрического профилирования после предварительного фракционирования на магнитных частицах (Пахарукова Н.А. с соавт., 2010, Pakharukova N.A. et al., 2011). Метод позволяет анализировать одновременно несколько десятков пептидов, белков и белковых фрагментов, однако может применяться только для определения молекул с весом до 17 кДа.

Широко распространенным методом анализа сложных белковых смесей в широком диапазоне молекулярных весов является двумерный гель-электрофорез (2-DE) (O’Farrell P.H., 1975). С помощью 2-DE можно осуществлять визуальное картирование протеома плазмы крови, проводить относительный количественный анализ и поиск дифференциально экспрессируемых белков.

Несмотря на активно ведущиеся исследования по протеомному профилированию патологических состояний, понятие «норма» в протеомике до сих не определено. Можно полагать, что качественный и количественный состав белков может изменяться в пределах заложенной на генетическом уровне нормы реакции, однако систематизированные представления о мере пластичности/консерватизма протеома плазмы крови здорового человека при воздействии на его организм различных факторов среды или условий жизнедеятельности в настоящий момент отсутствуют.

^ Целью работы являлась качественная и количественная оценка вариабельности белков плазмы крови здорового человека при воздействии на организм различных факторов, включая факторы, моделирующие эффекты микрогравитации. В рамках достижения указанной цели решались следующие задачи:

Получить методом двумерного электрофореза и охарактеризовать протеомную карту плазмы крови здорового человека после удаления мажорных и концентрирования минорных белков.

Выявить достоверно различающиеся по уровню содержания в плазме крови белки, определяющие внутри- и межиндивидуальные различия (пластичность) протеома здоровых людей.

Выявить изменения протеома плазмы крови здорового человека, вызванные воздействием экстремальных факторов («сухая» иммерсия и длительная изоляция).

Сопоставить пластичность протеома плазмы крови, обусловленную экстремальными условиями жизнедеятельности, с известными данными об изменении уровня содержания белков в плазме крови при патологии.

^ Научная новизна

Впервые было проведено исследование по выявлению пределов вариабельности протеома плазмы крови, характерных для нормального человека, в том числе связанных с экстремальными воздействиями. С помощью метода двумерного электрофореза были оценены изменения в протеоме плазмы крови здоровых людей в ходе наземных экспериментов по моделированию отдельных факторов космического полета - 7-суточная «сухая» иммерсия и 105-суточная изоляция в гермообъекте. Впервые показано, что колебания состава протеома проявляются как признаки адаптивной пластичности протеома, в частности, в период восстановления после перенесенного воздействия.

^ Практическая значимость работы

В работе решена проблема оценки пластичности протеома плазмы крови, препятствующая медицинскому освоению результатов протеомных исследований. Определены доверительные интервалы коэффициента вариации, в пределах которых количественные изменения белкового состава крови не связаны с молекулярным механизмом развития болезни, а отражают физиологическую норму реакции организма. Установлено, что для отдельных белков масштаб этих колебаний сопоставим с изменением уровня белков плазмы, наблюдаемым при патологии. Получена важная информация с точки зрения исследования индивидуальных защитных механизмов, повышающих функциональные резервы здорового человека при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды, в том числе и факторов космического полета.

^ Положения диссертации, выносимые на защиту

Двумерный гель-электрофорез в сочетании с пробоподготовкой с использованием пептидных микрогранул (ProteoMiner™) для удаления мажорных и концентрирования минорных белков является информативным и воспроизводимым методом анализа протеома плазмы крови здорового человека в диапазоне концентраций от 10-4 до 10-7 М.

Пребывание человека в условиях длительной изоляции в гермообъекте не вызывает выраженных изменений в протеоме плазмы крови, что сопоставимо с индивидуальными изменениями во времени, наблюдаемыми в условиях обычной жизнедеятельности.

Экстремальные условия жизнедеятельности, моделирующие эффекты микрогравитации («сухая» иммерсия), вызывают в период реадаптации после перенесенного воздействия существенные изменения содержания белков плазмы крови у здорового человека.

Адаптивное изменение уровня содержания белков крови, выявленных у здоровых добровольцев в экстремальных условиях жизнедеятельности, также наблюдается у пациентов как неспецифическая реакция организма в связи с развитием заболевания.

^ Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были представлены на 8 научных конференциях, в том числе и международные: 3-я протеомная конференция стран Центральной и Восточной Европы (Будапешт, Венгрия, 6-9 октября, 2009 г.); Российско-французско-белорусская конференция «Нейрососудистые изменения, вызванные воздействием условий внешней среды: молекулярно-клеточные и функциональные подходы» (Анже, Франция, 10-12 марта 2010 г.); 31-ый международный симпозиум по гравитационной физиологии (Триест, Италия, 13-18 июня, 2010 г.); I Международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 17-19 ноября 2010 г.); 18-й международный симпозиум «Человек в космосе» (Хьюстон, США, 11-15 апреля 2011г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах из перечня Высшей аттестационной комиссии Российской Федерации.

^ Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований с обсуждением, заключения, выводов, списка литературы и приложения. В диссертации приведены 11 таблиц и 24 рисунка. Список использованной литературы содержит 71 отечественных и 122 зарубежных источников.


^ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы исследования

Исследовали образцы плазмы крови 16 здоровых добровольцев, прошедших врачебно-экспертную комиссию ИМБП РАН и допущенных к участию в модельных экспериментах: 1 – 7-суточная «сухая» иммерсия - 5 мужчин в возрасте 23 - 29 лет, пробы крови отбирали за 7 суток до начала эксперимента, на 7-е сутки проведения эксперимента и через 7 суток после окончания эксперимента (период реадаптации); 2 – 105-ти суточная изоляция в гермообъекте – 6 мужчин в возрасте 26 - 41 лет, пробы крови отбирали за 6-7 суток до начала эксперимента, на 17, 51-52 и 85-86 сутки проведения эксперимента и на 7-8-е сутки после окончания эксперимента (период реадаптации); 3 – внутрииндивидуальная вариабельность в норме – 5 мужчин в возрасте 26 – 48 лет, пробы крови отбирали на 1-е, 14-е и 21-е сутки в привычных условиях жизнедеятельности. Процедуры и методики исследований были рассмотрены Комиссией по биомедицинской этике при ГНЦ РФ - ИМБП РАН, а от испытателей, принимавших участие в исследовании, было получено письменное Информированное согласие.

^ Методы исследования

Получение образцов плазмы крови. Пробы крови у испытуемых отбирали из локтевой вены утром натощак. ЭДТА плазму крови получали стандартным методом, замораживали и хранили при -80°С до проведения дальнейших протеомных исследований.

^ Получение обедненной фракции плазмы крови методом удаления мажорных и концентрирования минорных белков. Обедненную фракцию плазмы крови получали с помощью микрогранул ProteoMiner™ (Bio-Rad, США). 1 мл плазмы крови добавляли к спин-колонке с микрогранулами, дальнейшие шаги выполняли согласно инструкции производителя. На выходе получали 300 мкл элюата, замораживали и хранили при -20°С.

Проверку качества обеднения плазмы крови проводили по наличию пиков одно – (m/z=66,5 кДа) и двухзарядного (m/z=33,3 кДа) ионов альбумина с помощью прямого масс-спектрометрического профилирования цельной плазмы и обедненной фракции, полученной после обработки микрогранулами ProteoMiner™. Для этого подкисленные растворы плазмы и обедненной фракции пропускали через обращеннофазовые наконечники ZipTip C18 (Millipore, Франция). Полученный элюат смешивали с матрицей (синаповая кислота (SA)) в соотношении 1:1 и наносили на MALDI мишень AnchorChip (Bruker Daltonics, Германия). Спектры получали в линейном режиме на масс-спектрометре с времяпролетным анализатором Autoflex III TOF (Bruker Daltonics, Германия) в диапазоне масс 18 – 120 кДа.

^ Проведение двумерного электрофореза. Для выравнивания анализируемых двумерных электрофореграмм по общему белку перед проведением анализа методом двумерного электрофореза концентрацию белка в образцах обедненной фракции плазмы крови определяли по методу Брэдфорда (Bradford M.M., 1976) на вертикальном фотометре УНИПЛАН™ (Пикон, Россия). Измерение проводили по оптической плотности растворов при длине волны 530 нм. Пересчет оптической плотности в концентрацию осуществляли линейной аппроксимацией методом наименьших квадратов калибровочной прямой, построенной с использованием стандартных растворов бычьего сывороточного альбумина.

Для разделения белков по изоэлектрической точке аликвоты образца обедненной фракции плазмы крови, соответствующие 200 мкг белка, разводили буфером (7М мочевина, 2М тиомочевина, 4% CHAPS, 0,5% Амфолит рН 3-10 и 50мМ ДТТ) до конечного объема 200 мкл и наносили на 11 см стрип с иммобилизованным нелинейным градиентом рН 3-10 (Bio-Rad). Изоэлектрическое фокусирование проводили на приборе Protean IEF Cell (Bio-Rad) по следующей схеме: активная регидратация в течение 14 часов, 250 В в течение 30 минут, 5500 В до 35000 Вч и 800 В в течение 10 часов. Затем стрипы промывали в уравновешивающем буфере (6М мочевина, 50мМ Tris-HCl pH 6,8, 20% глицерин и 2% SDS) сначала с добавлением 1% ДТТ, а потом 2,5% акриламида по 30 минут соответсвенно. Для разделения белков на основании различия их размеров (молекулярных масс) и пространственных конфигураций стрипы переносили на самодельные 4%-12% Tris-HCl полиакриламидные гели (13,3×8,7 см). Разделение проводили в ячейке Criterion Dodeca Cell (Bio-Rad) в несколько стадий: 15 минут при 50 В, 30 минут при 150 В и около 40 минут при 175 В при постоянном охлаждении. Гели окрашивали 0,1% раствором Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250 (Sigma). Для усреднения технической погрешности метода каждый образец анализировали в двух-трех повторах.

^ Получение и анализ изображений гелей. Изображение гелей получали с помощью калибровочного денситометра Molecular Imager® GS-800™ (Bio-Rad) в режиме трансмиссии с разрешением 300 точек на дюйм. Анализ изображений гелей с определением интенсивности белковых пятен проводили с помощью программного пакета GelEditor (ИБМХ РАМН). Сводные данные интенсивности пятен по всем гелям переносили в Exсel для дальнейшего анализа.

^ Анализ данных. Все данные в работе представлены как среднее арифметическое значение ± стандартное отклонение (M±SD). Для оценки достоверности изменений и воспроизводимости метода вычислялся коэффициент вариации (CV) интенсивности для каждого пятна как отношение стандартного отклонения величины к ее среднему значению (CV=SD/M*100%).

Анализ распределения образцов по кластерам проводили с помощью иерархического кластерного анализа методом невзвешенного попарного арифметического среднего (программа Statistica 6.0). Расстояние между объектами (образцами плазмы крови) вычисляли с использованием коэффициента корреляции между профилями интенсивности белковых пятен на геле. Робастность результатов кластерного анализа оценивали путем моделирования выборок из эмпирического распределения значений интенсивности белковых пятен.

Статистический анализ проводили с использованием непараметрического критерия Уилкоксона (программа Statistica 6.0). Межгрупповые отличия считали достоверными при p<0,05.

^ Идентификация белковых пятен методом масс-спектрометрического анализа пептидных фрагментов (PMF). Вырезанные вручную из геля белковые пятна отмывали обесцвечивающим буфером (100 мМ бикарбоната аммония (NH4HCO3) в 50 % растворе ацетонитрила), дегидратировали 100% аценитрилом и подвергали трипсинолизу. Элюат пептидов смешивали с матрицей (2,5-дигидроксибензойная кислота (DHB)) и наносили на MALDI мишень AnchorChip.

Масс-спектрометрический анализ проводили на масс-спектрометре с время-пролетным анализатором Autoflex III TOF (Bruker Daltonics) в рефлекторном режиме в диапазоне масс 800 – 4500 Да. Полученные спектры обрабатывали с помощью программы FlexAnalysis 3.0 (Bruker Daltonics). Определение пиков в спектре осуществлялось алгоритмом SNAP после предварительного вычитания базовой линии типа «top hat» и сглаживания за счет удаления шумов с помощью математического фильтра методом Savitzki-Golay. В масс-лист включались только пики, для которых отношение сигнал/шум превышало 5. Перекалибровку масс-спектров проводили по пикам аутолиза трипсина с массой 842,509 Да и 2211,104 Да.

Поиск белков по набору масс пептидов проводили в программе Mascot v.2.1 (MatrixScience, Великобритания). Параметры поиска были следующие: база данных – NCBIr, вид организма – Homo sapiens, используемый фермент – трипсин, возможные модификации - Oxidation M, Propionamide C и точность определения масс пептидов – 100 ppm. Идентификацию белка считали достоверной, если вычисленный для него эмпирический критерий «Mascot score» превышал 63.


^ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Протеомная карта обедненной фракции плазмы крови здорового человека

Для создания протеомной карты здорового человека использовали двумерные электрофореграммы 60 образцов обедненной фракции плазмы крови, полученной после удаления мажорных и концентрирования минорных белков с использованием микрогранул ProteoMiner™ (Bio-Rad). Данный метод позволил значительно снизить концентрацию таких высокопредставленных белков, как альбумин и иммуноглобулины.

Всего было получено 150 двумерных электрофореграмм, то есть по 2-3 повтора на каждый из анализируемых 60 образцов. После окрашивания гелей Coomassie Brilliant Blue подсчитывали количество визуализированных белковых пятен на всех двумерных электрофореграммах. При подсчете не было выявлено статистически достоверных различий показателя среднего количества регистрируемых белковых пятен ни между экспериментами, ни между группами образцов в одном эксперименте (табл. 1).

Таблица 1. Среднее количество регистрируемых белковых пятен на электрофореграмме обедненной фракции плазмы крови в группах образцов


Эксперимент

Группа образцов

Среднее кол-во пятен на геле

В группе

В эксперименте

7-суточная «сухая» иммерсия

№1 - 5

118±17



117±15

№6 - 10

129±14

№11 - 15

111±13

Внутрииндивидуальная вариабельность в норме

№16 - 20

119±18



125±16

№21 - 25

124±15

№26 - 30

132±14

105-суточная изоляция в гермообъекте

№31 - 36

119±13



121±13

№37 - 42

119±14

№43 - 48

118±13

№49 - 54

124±12

№55 - 60

124±12


Среднее количество регистрируемых пятен на всех 150 двумерных электрофореграммах, полученных в ходе выполнения данной работы, составило 120±15. Эти данные соответствуют результатам других исследований, в которых изучали плазму крови человека методом 2-DE, с учетом размера гелей (13,3×8,7 см) и способа визуализации белков (Coomassie Brilliant Blue) (Ahmed N. et al., 2003, Kalenka A. et al., 2006, Archakov A. et al., 2009). На основании приведенных в таблице 1 данных можно утверждать, что условия модельных экспериментов не влияли на количество регистрируемых белковых пятен на двумерной электрофореграмме, и в ходе проведения исследования были достигнуты условия воспроизводимости анализа плазмы крови методом двумерного электрофореза.

Для белковых пятен, регистрируемых на полученных двумерных электрофореграммах, анализировали встречаемость на всех 150 гелях. Результаты анализа приведены на гистограмме, показанной на рисунке 1.




Рисунок 1. Гистограмма распределения частоты встречаемости регистрируемых белковых пятен на полученных гелях обедненной фракции плазмы крови здоровых добровольцев.


Видно, что 40% белковых пятен наблюдали на всех полученных гелях (100%). Более 70% пятен наблюдались не менее чем на половине гелей, и только 30% встречались менее чем на 50% гелей. Редко встречающиеся пятна чаще всего характеризовались низким уровнем интенсивности, и их низкая воспроизводимость может объясняться как технической погрешностью метода протеомного анализа, так и пределом чувствительности выбранного метода визуализации белковых пятен (Coomassie Brilliant Blue, до 10-7-10-8М).

^ Оценка воспроизводимости аналитического метода (определение технической погрешности 2-DE). Воспроизводимость метода двумерного электрофореза анализировали с помощью расчета коэффициента технической вариации. Для этого по техническим повторам анализа образцов оценивали разброс стандартного отклонения относительно средней величины интенсивности каждого пятна на двумерной электрофореграмме. На гистограмме распределения коэффициента технической вариации интенсивности белковых пятен, наблюдавшихся на полученных двумерных электрофореграммах, видно, что для 45% пятен коэффициент составил менее 20%, и только для 22 пятен из 140 проанализированных (16%) он превысил 30% (рис. 2).




Рисунок 2. Гистограмма распределения коэффициента технической вариации метода для регистрируемых белковых пятен на двумерных электрофореграммах обедненной фракции плазмы крови.


В среднем по всем образцам коэффициент технической вариации интенсивности белковых пятен составил 22%, что совпадает с данными других авторов, использовавших метод двумерного электрофореза для анализа протеома плазмы крови человека (Corzett T.H. et al., 2006, Winkler W. et al., 2008).

^ Аннотирование мастер-геля. В качестве мастер-геля была взята двумерная электрофореграмма с максимальным количеством регистрируемых белковых пятен. На таком геле было визуализировано 140 белковых пятен, 70 из которых выявлялись более чем на 70% всех полученных в ходе данной работы электрофореграмм. Результаты идентификации пятен методом масс-спектрометрического картирования пептидных фрагментов показали, что на полученной протеомной карте наиболее интенсивно окрашенные группы пятен относились к следующим белкам плазмы крови: витронектин, протромбин, сывороточный альбумин, α-, β- и γ-цепи фибриногена и аполипопротеины A-I, A-IV и Е. Путем сопоставления результатов масс-спектрометрической идентификации белковых пятен на мастер-геле с аннотированными электрофореграммами плазмы крови человека, депонированными в базе данных SWISS-2DPAGE (http://www.expasy.ch/swiss-2dpage/viewer), было установлено, что полученная протеомная карта обедненной фракции плазмы крови совпадает с типовой картиной разделения белков плазмы крови методом 2-DE.

Для дальнейшего анализа были определены 70 пятен с высокой частотой встречаемости (регистрировались не менее чем на 70% гелей) и относительно низкой погрешностью измерений (коэффициент технической вариации не более 25%).

6348971268905874.html
6349084010987720.html
6349181089606899.html
6349327927987951.html
6349427414884341.html